westernblot原理及步骤(westernblot原理及步骤rage)

1、western blotting 的过程和原理

   什么理论过程？就是原理呗？ WesternBlot原理、显色分类及操作步骤 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。 western显色的方法主要有以下几种： 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 二、操作步骤： (一)配胶 1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于分钟），加入%AP（，%）及TEMED（，：）即可，如室温较低可升高%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。 2、封胶： 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜%，浓度＞%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，。封胶后切记，勿动。 待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。 O冲洗胶孔两遍以去除残胶，。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 (%的AP最好现配现用，如在%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.) (二)样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵对于μl，×loadingbuffer。 ⑶℃，1min。 ⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸min，期间vortex2~3次。 ⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上~min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（~次。 ⑷g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于℃一周，天，每次上样前min。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于℃一周，天，每次上样前min。 (裂解液配方：TrisCl()mM 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。）。 %β巯基乙醇，‰溴酚蓝，×~5×，注意SDS终浓度勿超过%。 对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。) (三)电泳 1．上样前将胶板下的气泡赶走。 ×loadingbuffer调整至与样品等体积。 时改为稳压电泳。 3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。 电泳液配方：Trisbase3g,（ml%SDS）/L （5ml%SDS）/ (四)转膜 分钟左右戴上手套开始准备： 湿转使用常规电转液：，，MOHml。干转则取此转移液，每ml加入%SDSul。 浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PDF膜则在MOH中浸泡min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。 2．取胶： 将胶卸下，保留KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路） 3．转膜： 湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入mA，4h。注意不同蛋白的要不同。 干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，。负载电压不宜超过1/cm2胶面积。 电转液配方：Trisbase3g, (五)封闭及杂交 1．封闭： 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 2．结合一抗： 一抗的准备：使用反贴法时每张膜约需2ml一抗稀释液。 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。 3．洗涤： 一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5min。 4．结合二抗： 根据一抗选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:~1:），室温轻摇一小时。 5．洗涤： 二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5min。 PBST：℃) 封闭液与抗体溶剂均为含mlPBST或TTBS加入g脱脂奶粉即为封闭液。 (六)发光鉴定 一般使用辣根过氧化物酶HRPECL发光法或碱性磷酸酶APNBT/BICP显色法。 1．HRPECL发光法： 将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。 2．APNBT/BICP显色法： 每片NBT/BICP可溶解于×s后每s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。 背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。 三、注意事项： 增强敏感性 若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度： 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。 将膜在PBST或TTBS中洗涤次液。 封闭min 一抗杂交，室温h会更强，但可能增加非特异条带。 PBST或TTBS洗膜次液。 二抗杂交，h。 PBST或TTBS洗膜次液。 发光鉴定。 若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜次液。 ．三抗杂交，室温h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。 ．PBST或TTBS洗涤膜次液。 ．发光鉴定。 ℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试） (七)NC膜的多次使用 一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤次，再从封闭开始，后续步骤同前。 对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于次，再从封闭开始，后续步骤同前。

2、western blot 的工作原理

   与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 工作原理和操作步骤详见： 可以免费下载的。 工作原理 Y|_2IU 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(v SDSPAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. }~ &A 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. T&ZpP_] 原理：先制备蛋白质样品，再利用sdspage原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原一抗二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。

3、什么是Westernblot法及Westernblot法应用

   什么是Westernblot法：Westernblot法是一种将电泳与KIJSA结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。 Westernblot法应用：Westernblot法应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 蛋白质分析中应用的Western杂交法与DNA分析应用的Southern杂交法相似，均是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，并均以针对特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern杂交法)序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。 对于蛋白质来说，通常使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。Westernblot法的主要优点在于，它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上通过电转移到一张合适的印迹膜上，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需俊免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有用。此外，由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题全都无需加以考虑。 伯乐生命biorad TransBlot 转印槽是一种多功能仪器，适用于多种Westernblot法应用。多组参数灵活可设，可调节的电压设置（从 小时快速实验）。电极间距设置为°C）或高强度转印的理想选择，随着转印时间增加（多达小时），不会引起缓冲液耗竭。

4、请教Westen blot的详细操作步骤

   蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 多少细胞可以提蛋白做westen blot要看具体的表达水平的 正常来说，如果是用6孔板来做的，一个孔的细胞就够了 如果可以数的话，差不多六次方级别的细胞数也足够做一次westen blot了 所以多少细胞可以提蛋白做westen blot要看具体的表达水平的

5、什么是Westernblot法及Westernblot法目标？

    伯乐生命Westernblot法（即蛋白质印迹法）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。（如：伯乐生命的印迹膜上TPN蛋白定量方法及3?Western流程）。

6、western blot 具体操作步骤

   什么是Westernblot? 最佳答案 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、试剂准备 1、SDSPAGE试剂:见电泳实验。 2、匀浆缓冲液： TrisHCl(pH )；%SDS ；β巯基乙醇 ；ddH2O 。 O定容至ml。 ；KHO至ml。 ml；ddH2O ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）： PBS中。 。 三、操作步骤 （一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，。然后g离心min。取上清液作为样品。 （二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDSPAGE。 （三）转移：（半干式转移） 次。 2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中min。 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压，。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。 （四）免疫反应： 次。 2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。 次。 %BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。 min×4次。 6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（ PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。 次。 8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 四、注意事项 1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 。 3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细