rt-pcr原理(RT—PCR实验原理及步骤)

1、RT-PCR法是什么?

   RTPCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcriptionPCR, RTPCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RTPCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 rtpcr简介 rtpcr是将rna的反转录（rt）和cdna的聚合酶链式扩增（pcr）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从rna合成 cdna，再以cdna为模板，扩增合成目的片段。rtpcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。作为模板的rna可以是总rna、mrna或体外转录的rna产物。无论使用何种rna，关键是确保rna中无rna酶和基因组dna的污染。使用天为时代的总rna提取系统（如目录 dp），所获得的rna的纯度高，基因组dna污染少，用于rtpcr系统可得到满意结果。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、oligo dt 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mrna，三种都可。

2、RT-PCR实验操作的注意事项

   在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RTPCR技术。 真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA?PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内隔开的，这些编码区叫做外（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。 所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RTPCR这条颇费周折的途径。 1．RNA的提取 RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 ……………… 详细资料请参考：on???

3、PCR和RT -PCR的区别与联系

   PCR这里是指常规的PCR吧？就是以DNA为模板，dNTP为原料，在Taq DNA聚合酶的作用下，扩增DNA。RTPCR即Reverse transcriptionPCR，顾名思义就是讲mRNA通过反转录成第一链cDNA后，以第一链cDNA为模板进行PCR。 你所说的pcr应该就是最常规的pcr，以dna为模板，通过上下游引物，实现dna的扩增 rtpcr一般情况下是指反转录pcr（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量pcr也（realtime fluorescence quantitative pcr）也简称rtpcr，但是我觉得这是不对的，不推荐。基本操作过程是将所提取的rna进行反转录，然后将所获得的cdna作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。 实时荧光定量pcr也就是realtime pcr，原理有点多，请自行百科，其最大的作用是检测样品中的初始dna浓度。 至于三者的关系，rtpcr和实时定量pcr应该都属于pcr，在rna实验中，这二者都会应用到。例如你要比较个组织中有表达，然后通过实时定量pcr测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异

4、我想知道RT-PCR的原理

   DNA复制即碱基互补配对 和DNA在高温变性在低温时又可以复性 逆转录聚合酶链反应 (Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction，RTPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖dna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。 rtpcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。rtpcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。（检测基因表达的方法，参见northern blot法。 rtpcr的关键步骤在是rna的反转录，要rna模版为完整的且不含dna、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,amv）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,mmlv）反转录酶。 rtpcr有时候也会指代实时pcr(realtime pcr)。为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtqpcr(realtime quantitative pcr)。 逆转录聚合酶链反应 (Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction，RTPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达

5、rt pcr的原理及步骤

   原理：RTPCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real timePCR）(reverse transcriptionPCR,RTPCR),是聚合酶链式反应(PCR). 步骤：（一）预变性： 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组的DNA模板,. （二）变性退火延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链.（三）PCR仪扩增循环后度延伸分钟。 RTPCR 就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录 PCR（reverse transcriptionPCR, RTPCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在 RTPCR 中，一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量，在扩增过程中，荧光信随着PCR产物的增加而增强。我们实验室使用的BIOGHSC Super Probe Kit PCR实验检测DNA,测得的循环数在个阶段，基线期指数增长期线性增长期平台期，指数增长期内，PCR有高度重复性，一般的检测指标是看线性图谱的扩增曲线的起跳值（CT值）。