rna干扰阻断技术原理(rna干扰技术的原理及应用)
1、RNAi 的原理是什么?
RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。同时作为一项新兴生物技术，RNAi有着广泛的应用前景。本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景。 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post transcriptional gene silence , PTGS)。 各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。 rna干扰的分子抑制机制的三种方式及原理
2、什么是RNA干扰技术
法尔和梅洛于年正式发表论文,公布了有关rna干扰机制的发现。以他们的发现为基础,rna干扰技术近年来迅速兴起,其前景被普遍看好。rna能够充当“信使”,传递dna(脱氧核糖核酸)上的遗传信息,将其用于蛋白质的生产合成。研究显示,向生物体内注入小rna片段,会干扰生物体本身的rna“信使”功能,导致相应蛋白质无法合成,从而“关闭”特定基因。科学家认为,采用rna干扰技术直接从上让致病基因“沉默”,也许可以更有效地治疗某些疾病。 这种技术最初曾被用来研究植物和蠕虫等,科学家后来发现它对哺乳动物细胞也有效。例如,美国哈佛医学院的科学家已经成功地利用rna干扰技术治愈了实验鼠的肝炎。目前,rna干扰治疗技术正在快速进入人体试验阶段。一些正在资助用这项技术治疗黄斑变性、乙肝等疾病的试验。 不过，尚有几个难题。首先，科学家还没有找到一种方便快捷的方法，使rna干扰能在患者体内的有效部位进行。其次，科学家还无法确定这种疗法是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用。 生物合成蛋白质的过程是DNA经转录酶转录成RNA，核糖体根据RNA上的碱基排列来合成蛋白质。有些病毒没有DNA他们的DNA也是靠RNA来逆转录成的 干扰技术就是通过干扰素来阻止DNA和RNA之间的转录来阻止细胞合成蛋白质，从而达到杀灭病毒的目的。 这种方法治疗没有什么毒副作用，并且被认为可以治百病的技术，是根治艾滋病的有效途径，世界的科学家都在研究这技术。 了老半天的字，给点表示把，了我就得分了
3、RNA干扰？？
【百科】RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 是指翻译过程中 rna与信使rna结合 干扰了翻译过程
4、干扰RNA的作用机制与应用前景是什么
RNAi历史 RNAi现象早在年就有报道： 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到年，Andrew Fire 和 Craig Mello的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。 RNAi作用机理 大约 nt的siRNA，而后这些siRNA被组装进入一种RNA依赖的沉默复合物。最后，这些siRNA与RNA分子互补配对，并引导RISC剪切、降解RNA分子。在哺乳动物中，>nt) siRNA可以避免哺乳动物的抗病毒效应，正确行使RNAi功能。 化学合成siRNA的优势 越来越多的研究人员开始采用RNAi技术研究基因功能组学，药物靶点筛选，细胞信通路分析等。 RNAi药物研发进展 RNAi已经成为目前基因功能研究，药靶发现以及药物开发的基础，RNAi药物将有望成为的一种更为高效快捷的疾病治疗途径。siRNA在临床上应用必须克服技术上难题，主要包括改善siRNA药物动力学特性，避免脱靶效应和干扰素反应等。核酸化学和导入方面取得了巨大的进展，使得RNAi治疗法更具前景和潜能，RNAi药物势必大大推动临床药物开发进程，为临床治疗带来一场革命性变革。 过去的几年里，很多在RNAi领域都取得了很大的成就。初步统计，大约有个正在开发种反义核酸药物。这些药物主要集中在癌症、肿瘤、心血管、眼部、抗病毒、呼吸道、抗菌、糖尿病等方面。目前Alnylan、默克、罗氏处于RNAi药物研究的第一阵营，其他大也都在开展siRNA药物的研发合作或独立研究。 RNAi药物实例 月美国基因治疗学会年会上公布了世界首次 siRNA临床试验获成功这一振奋人心的消息。这项临床试验表明，靶向血管内皮生长因子（EGF）基因的siRNA能够有效治疗老年性黄斑变性（AMD）。这项试验的成果是RNA疗法发展的一个里程碑，siRNA将在不久成为高效的分子药物应用于临床治疗。近年来，针对多种疾病的siRNA药物已经相继进入临床试验的不同阶段。大家可能注意到，绝大多数RNAi药物都是化学合成siRNA，原因存在多个方面：操作简便、可控；转染效率较高；对细胞毒副作用小；可进行各种修饰、连接；可大规模筛选；可大规模制备等。 事实上，很多制药在RNAi上投入了大量的资源，以 siRNA 作为治疗手段的前景诱人， siRNA 从发现到现在短短几年的时间内，第一个 RNAi 药物 Bevasiranib （ Acuity ）已经诞生 , 用于治疗湿性老年性黄斑变性 (AMD) 。 据报道：FDA已经批准了Quark药业用于肾移植病人的试验siRNA药物DGFi的新药临床试验申请。在年下半年，I期或II期临床试验已启动。 目前Alnylam是RNAi药物研发的领头羊，它的siRNA研究领域比较广，已经有一些RNAi药物在临床阶段，尤其是在抗病毒方面有的已经到临床三期了，预计RNAi药物五年内就可以上市了。Alnylam开发的 RNAi 药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等。siRNA作为药物会比一般小分子药物开发要快，选择性会更好，如果能够更好地解决药物靶细胞递送，相信可以治疗许多现在药物治疗效果不理想的疾病。 我国在创新药物方面的研究还远远落后于西方国家。而RNAi 技术的发展历史很短，是一项刚刚兴起不久的生物技术，虽然我们目前已经与发达国家有一定差距，但差距仅有几年的时间，如果我们加速发展，完全有条件赶超发达国家，有可能在一定时期内在创新药物开发方面取得突破性进展。特别是，利用这一技术可弥补我国在化学制药方面与发达国家之间的巨大差距。这一项新技术给我们带来了一个千载难逢的发展机遇。 rna干涉(rna interference,rnai)[的反义rna时,如预期那样阻断了该基因的表达,但当在对照组注射正义rna时以期待观察到该基因表达增强时,却发现该基因同样被抑制,该研究小组一直没能给出合理的解释. rna干涉(rnai)技术是利用一些小的双链rna来高效、特异地阻断体内特定基因的表达，并促使mrna降解，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。在rnai技术的历史、作用机制、研究策略、研究现状方面应用前景不错，预测rnai将会给基因治疗的发展带来新的希望。
5、RNA的干扰原理
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是通过抑制转录后水平的基因表达而诱导功能缺失表型的有力工具。由dsRNA（doublestranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用。 dsRNA（doublestranded RNA）可以介导基因沉默作用，以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于个碱基，其中个碱基配对，再每条链的3’端都有2个不配对的碱基。 另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白质的合成。长的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子，导致翻译抑制。也可以通过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L，导致非特异的RNA降解。 关于特异性的RNA作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段。起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，属内切核酸酶）的作用下加工裂解核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA）。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。 在RNAi 的效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA－induced silencingplex or RISC），在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。 【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse anisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient is the mode of sequencespecific posttranscriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous doublestranded RNA(dsRNA). discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug. 【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) doublestranded RNA(dsRNA) RNAinduced silencingplex(RISC) Argonaute pol III 1l的，这个还没到rna干扰的范畴吧，顶多就是停留在分子生物学。 你用什么方法在过渡载体上重组两个干扰片段的呢？你提到了引物，那么似乎是标准的pcr酶切连接的方法。那么如果你设计的双酶切不是同尾酶的话，连接方向是不可能出问题的，反过来连不上啊。 你可以检查一下你的引物和模板，如果确认设计的方向没问题的话，插入方向是不会有问题的。无需测序。 酶切出来条带奇怪，有可能是酶切本身的原因。比如你用的什么酶？会不会有星活性？你的过渡载体上会不会有多个你用到的酶的切点？ 如果不涉及保密内容，不妨稍详细的介绍一下你的实验方法，大家一起讨论=)
