全自动蛋白表达系统原理(白蛋白功能)

1、westernblot的原理及操作步骤，应用有哪些

   原理 Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,. 分类 Western Blot显色的方法主要有以下几种： 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带. 其他 值得一提的是,western blot blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了. 原理 western blot与uthern印迹杂交或northern印迹杂交方法类似，但western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜nc膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 分类 western blot显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ecl iii. 底物荧光ecf iv. 底物dab呈色 现常用的有底物化学发光ecl和底物dab呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ecl。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用hrp标记）：反应底物为过氧化物鲁米诺，如遇到hrp，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 其他 值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做uthern的科学家，但印迹的对象是dna链，他把这种技术称为uthern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对rna，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为northern和western，与这两个技术的发明人没有关系了。

2、western blot的实验原理(详细的)

   蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和 免疫学检测三个部分组成。 第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳） ，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。 第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。 Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品(跑PAGE 胶的原理你懂吧~~~)，转移到固相载体（硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜）。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。